Die zur Gruppe der Polyen-Antimykotika gehörende Substanz besteht aus einem glykosidisch gebundenen Aminozucker und einem makrocyclischen Lactonring (hydrophil), der eine hydrophobe Seite, bestehend aus einer Kohlenwasserstoffkette mit vielen konjugierten Doppelbindungen (Polyen), hat. Über diese hydrophobe Seite, die in ihrer Struktur den Sterinen sehr ähnlich ist (starres, planares, hydrophobes, durchkonjugiertes Doppelbindungssystem etwa gleicher Länge), kann sich das Molekül an das Ergosterol in der Pilzzellmembran anlagern.  Dabei treffen je nach Literatur bis zu acht Amphotericin B Moleküle aufeinander, welche eine Wasser-gefüllte Pore in der Membran hinterlassen. Durch diese Pore können Teilchen < 4-8 Angström (Ionen, Wasser aber keine Makromoleküle) die Zelle verlassen. Die betroffene Pilzzelle läuft sozusagen aus und geht daher zugrunde, womit Amphotericin B fungizid wirkt.

Da das Cholesterol der menschlichen Zellen dem Ergosterol der Pilze strukturell sehr ähnlich ist, können sich Polyen-Antimykotika auch an dieses anlagern. Aus diesem unspezifischen Mechanismus resultieren damit sowohl die Wirkungen als auch die Nebenwirkungen. Bei oral angewendeten Zubereitungen beschränken sich die Nebenwirkungen meist auf den Gastrointestinaltrakt, da sie kaum resorbiert werden.

Zubereitungen zur Anwendung in der Mundhöhle sollten nach den Mahlzeiten appliziert werden und so lange wie möglich im Mund gehalten werden. Danach werden sie geschluckt.

Suspensionen müssen vor Anwendung geschüttelt werden.

Die Dosis von peroralen Zubereitungen kann bei Bedarf ohne Bedenken auf bis zu 12 x 500.000 IE pro Tag erhöht werden.

Eine Anwendung sollte im Allgemeinen für zwei Wochen erfolgen und nicht länger als vier Wochen dauern. Sind die Beschwerden schnell abgeklungen, so kann auch kürzer als zwei Wochen therapiert werden, doch sollte die Einnahme immer zwei Tage über das Verschwinden der Beschwerden hinaus fortgesetzt werden.

Die Therapie von Hautmykosen sollte noch 8-10 Tage nach Abklingen der Symptome fortgesetzt werden, um eine Reinfektion zu vermeiden.

Bei der Therapie von vaginalen Mykosen sollten drei Tage lang abends zwei Tabletten/Ovula tief in die Scheide appliziert werden oder 6 Tage lang eine Tablette/Ovulum. Bei schweren Mykosen können Dosis und Therapiedauer auch erhöht werden.

Da Nystatin kaum resorbiert wird, kommt es nur zu einer lokalen Wirkung auf der Haut oder auf Schleimhäuten (z. B. Mund-, Rachen-, Lungen-, Darmschleimhaut).